В каких продуктах содержится гиалуроновая кислота. Гиалуроновая кислота распространение в природе Механизм действия гиалуроновой кислоты

Сценарии

Гиалуроновая кислота была открыта в 1934 году, первые же детальные ее исследования начали проводиться в 1949 – 1950 годах. Это вещество было выделено из различных тканей животных - суставной жидкости, пуповины и тканей петушиного гребня. Кроме того, в 1937 году гиалуроновую кислоту удалось получить из капсул стрептококков. Первые исследования физических и химических свойств гиалуроновой кислоты проводились методом рентгеновской кристаллографии.

Проблемы получения ГК

Основной проблемой при исследовании гиалуроновой кислоты, с которой столкнулись ученые, была сложность ее выделения в чистом виде, очищенной от белков и иных компонентов. Трудность возникала потому, что всегда имел место риск разрушения полимерной структуры гиалуроновой кислоты в процессе очистки. При этом ученые испробовали разнообразные методы физической, химической и ферментативной очистки.

Чуть позже начались исследования возможности биосинтеза гиалуроновой кислоты. В 1955 году такой способ впервые был найден. Группа ученых выделила молекулы гиалуроновой кислоты из экстракта стрептококков. Благодаря этому открытию стало возможным синтезировать гиалуроновую кислоту - используя ферментативную фракцию, взятую из стрептококков.

Гиалуроновая кислота - Применение

Главный прорыв в применении гиалуроновой кислоты произошел в 50-ые годы. Благодаря открытию этого вещества для использования в медицине, было начато его промышленное производство и популяризация в качестве лекарственного средства.

В 1970 году гиалуроновая кислота была утверждена, как доказано эффективное средство от артритов - после получения положительных результатов тестирования на животных. В результате проведенного опыта был отмечен выраженный клинический эффект с уменьшением симптомов.

Несколькими годами позже гиалуроновую кислоту начали использовать в составе имплантируемых внутриглазных линз, что быстро сделало ее одним из наиболее часто использующихся компонентов в хирургической офтальмологии. С этого момента стали предлагаться и испытываться различные способы и области применения гиалуроновой кислоты.

ГК на сегодняшний день

В 90-е годы гиалуроновая кислота нашла широкое применение в эстетической медицине и косметологии, благодаря своим уникальным влагоудерживающим, а также антисептическим и антиоксидантным свойствам. По настоящее время она используется в различных косметологических целях, а исследования ее свойств и возможных областей применения продолжаются.

Здравствуйте, Друзья мои! Гиалуроновая кислота – одно из многих важных составляющих нашего организма. В основном мы знаем это название из рекламы косметических средств, хотя это далеко не только крем от морщин. Гиалуроновая кислота является очень важным средством лечения и облегчения болей в ортопедии при проблемах с суставами. Я постараюсь рассказать всё про эту необычную кислоту от А до Я и разберём как выбирать и где купить препараты с гиалуроновой кислотой, чтобы не ошибиться. Но обо всём по порядку.

Гиалуроновая кислота (другие названия: гиалуронат, гиалуронан, Hyaluronic Acid, Sodium Hyaluronate-гиалуронат натрия) – очень важное вещество, входящее в состав кожи, нервных и соединительных тканей, межклеточной жидкости. Является одним из основных компонентов межклеточного вещества (по-научному матрикса), синовиальной (суставной) жидкости, хрящевой ткани, слюны, входит в состав стекловидного тела глаз и др. Именно эта кислота превращает воду в гель в организме человека и удерживает её в тканях, насыщая их влагой.

Гиалуроновая кислота — самое естественное и полезное вещество, которое можно вколоть в сустав.

Самое главное отличие этих препаратов — наличие высокомолекулярной или низкомолекулярной гиалуроновой кислоты. От этого зависит количество уколов на курс, цель лечения и стоимость.

По каким принципам назначаются препараты? Рассуждения просты. Если требуется улучшить смазывающие свойства в суставе, создать что-то типа искусственного смазочного слоя, который будет некоторое время находиться в суставе и выполнять роль естественной синовиальной жидкости, то вводят высокомолекулярную модифицированную кислоту. Для её рассасывания требуется время, поэтому несколько месяцев после курса инъекций она способна выполнять свои функции. Кислота постепенно расщепляется специальными ферментами, проникает в кровоток через суставную сумку, а потом в печени распадается на воду и углекислый газ. Потом требуется повторная инъекция.

Если требуется обеспечить хрящ дополнительным питанием, подтолкнуть клетки к естественному росту, затормозить дегенеративные изменения в хряще или помочь суставу быстрее восстановить свою собственную жидкость, например, после на суставе (в процессе операции всё внутри сустава промывается), то используют низкомолекулярную кислоту, способную легко проникать между клеток.

При операциях на хряще, артрозах, коксартрозах и других суставных проблемах и даже при сильных нагрузках у спортсменов, рекомендовано раз в год делать инъекции таким препаратом.

Но прошу понять правильно. Что бы там ни было, но лезть в сустав, пусть даже с очень полезной гиалуроновой кислотой, — самое последнее дело. Если всё хорошо, но вам что-то там кажется, то лучше пейте кислоту и воду, пейте хондропротекторы для профилактики. И пусть никогда не придётся лезть в сустав. В любом случае, укол — это нарушение внутренней очень сложной среды сустава, что не есть хорошо.

Эффективность высокомолекулярной и низкомолекулярной гиалуроновой кислоты

Исследования эффективности кислот разного молекулярного веса проводились и выяснилось, что процессы эти достаточно сложны и однозначно сказать какой молекулярный вес наиболее эффективен пока сложно. Чем выше молекулярный вес, тем больше упругость кислоты. А упругость как механическое свойство меняется от движения (вот вам опять подтверждение ).

Гиалуроновая кислота проявляет себя больше как смазывающее вещество при медленных движениях и как амортизирующее вещество при быстрых движениях, ударах и прыжках.

Наш организм и происходящие в нас процессы достаточно сложны. Многое непонятно, но в целом надо знать, что чем крупнее молекула кислоты, тем сложнее ей проникать к клеткам и через синовиальную оболочку сустава, да и в любую другую ткань организма.

Как уже было сказано, молекулярный вес гиалуроновой кислоты, в естественном состоянии вырабатываемой суставом, около 3 000 000 Да. Этих показателей и стоит придерживаться. При заболеваниях суставов, в зависимости от состояния хряща и собственной суставной жидкости, врач подбирает наиболее подходящий препарат.

Способность усваивать кислоту хрящами и проникать в суставы постоянно меняется и зависит от многих причин, в том числе наличия заболеваний и индивидуального состава суставной жидкости. Обычно на курс назначается несколько инъекций и в большинстве случаев гиалуронаты распадаются и выводятся из сустава быстро. Но в общем было замечено, что кислота со средней молекулярной массой около 2-3 млн Да более эффективно проникает в поврежденные ткани чем высокомолекулярная.

Сейчас принято считать, что гиалуроновая кислота с молекулярным весом около 2-3 млн Да, что соответствует кислоте, содержащейся в здоровой синовиальной жидкости сустава, наиболее эффективно способна обеспечить необходимые свойства внутренней среде сустава и обеспечить защиту и питание хряща. На этом и остановимся, пока не открыли ещё что-нибудь.

Побочные эффекты и противопоказания при приёме гиалуроновой кислоты

Гиалуроновая кислота связывает воду и превращает её в гель. Если не будет хватать воды, то в результате такого обезвоживания могут появиться головные боли, подняться давление, кожа не увлажнится, а будет сухой. Так что пить больше воды, особенно при приёме гиалуроновой кислоты, нужно обязательно.
При заболевании лимфатической системы, что сопровождается отёками, лучше не принимать добавки с гиалуроновой кислотой — это может усугубить проблему.
Естественен запрет для женщин в период беременности и кормления.
Не рекомендуется детям до 15 лет. Нет исследований и испытаний и просто ни к чему. А если у ребёнка проблемы с хрустом суставов, сухостью кожи или что-то другое, то причину надо искать в другом месте.
Индивидуальная непереносимость и особенности организма. В добавках с гиалуроновой кислотой возможно наличие балластных веществ (это уже зависит от производителей и качества полученной кислоты). Избавиться от них при производстве невозможно. Именно они могут вызывать реакции со стороны желудочно-кишечного тракта или аллергии.

Важнейшим показателем чистоты и качества гиалуроновой кислоты является остаточное количество клеточных структур, белков, липидов и т.д. Надо понимать, что чем больше подвергать ГК очистки, тем больше её потеряется, что увеличит стоимость конечного сырья. Сама же гиалуроновая кислота абсолютно биосовместима и естественна для организма человека. При проблемах стоит попробовать другой вид кислоты, либо другого более известного и надёжного производителя. Правило дешевизны здесь тоже применимо.

Осторожно обращаться с ГК и её повышенным количеством необходимо при явных заболеваниях и проблемах с почками. Думаю понятно почему: здесь уже другой водный режим и условия. Здесь без врача никак. Нарушение водного баланса в организме – не лучшее условие для экспериментов с гиалуроновой кислотой.

Как видите, появление таких побочных эффектов вызвано не самой кислотой, а наличием уже существующих проблем и элементарным незнанием.

Поэтому в идеале, особенно, если делать инъекции гиалуроновой кислоты, внедрять её в организм напрямую, необходимо знать не только молекулярный вес, но и степень очистки, источники исходного сырья и методы получения кислоты.

Вот почему все эти протезы синовиальной жидкости с раствором ГК, косметологические инъекционные препараты так дороги. Да и добавки с ГК не могут стоить, как говорится, пять копеек.

Сколько, кому и как принимать гиалуроновую кислоту – правила и нормы приёма

Выработка гиалуроновой кислоты замедляется после 25-30 лет, аналогично с . У них тесная взаимосвязь. Поэтому пить до этого возраста, при отсутствии травм суставов, гиалуроновую кислоту ни к чему, а после рекомендуется, особенно, если есть нагрузка на опорно-двигательный аппарат или появляются проблемы с сухостью кожи или суставами. Говорят, что лучше её пить, чем не пить.

Что касается инъекций гиалуроновой кислоты с косметическими целями или лечебными, то тут всё понятно: препараты должны подбираться врачом в индивидуальном порядке и проводиться в условиях стерильности.

Что касается различных косметических средств на основе гиалуроновой кислоты, то они должны применяться на влажную кожу (даже мокрую). В таком случае гиалуроновая кислота, оставаясь в верхних слоях кожи и образуя защитную влагоудерживающую плёнку, или проникая в более глубокие слои, притянет и удержит влагу.

Свойства кислоты уникальны: она притягивает воду, превращая её в гель и не отдаёт её даже в условиях сухости окружающей среды.

Если же наносить жидкую гиалуроновую кислоту на сухую кожу, то, не сумев проникнуть глубоко, она будет вытягивать влагу из кожи, что приведёт к обратному эффекту — сухости и стянутости. Таковы рекомендации лучших косметологов мира.

Кислота производится организмом постоянно, постоянно она и разрушается. Как и многие другие, с возрастом процессы разрушения начинают преобладать, поэтому давая организму больше ГК, мы стимулируем её выработку, увеличиваем количество и качество.

Разрушается ГК и под воздействие сильных механических нагрузок. Понятное дело, что имеются в виду суставы и хрящи. Поэтому при заболеваниях суставов пить ГК курсами очень желательно. Отсюда рекомендация спортсменам также принимать эту добавку.

Норма приёма ГК в сутки не установлена. Но к какому-то знаменателю надо прийти. Поэтому была определена норма в 100-150 мг в день. Это средняя профилактическая доза.

Если есть проблема и нужно добиться лечебного эффекта, то можно повысить до 300 мг в сутки. Повышенное количество лучше не пить больше 1 месяца. Надо следить за своим водным режимом и не допускать обезвоживания организма. У каждого всё индивидуально, но если появились ощущения жажды и сухости, то лучше снизить дозу.

Самое главное условие: пить достаточное количество воды, особенно при приёме повышенного количества кислоты в лечебных целях. Строго соблюдать норму потребления во избежание нежелательного обратного эффекта!

Следующая рекомендация касается сопровождения. Имея тесную связь с коллагеном в организме, как и у коллагеновых добавок, есть аналогичное правило – для лучшего усвоения гиалуроновой кислоты необходимы достаточные дозы витамина С. Я бы добавил, что лучше иметь в рационе питания все необходимые витамины и минералы. В любом случае, не помешает. Как? Решайте сами с учётом своих возможностей и образа жизни – , либо качественным и сбалансированным питанием.

Для достижения наилучшего эффекта гиалуроновую кислоту рекомендуется пить с коллагеном.

Как пить коллаген можно прочесть . Не обязательно сразу за один приём, имеется в виду суточный приём.

Также считается, что самый лучший и эффективный способ употребления добавок с ГК – это рассасывание.

Это не лишено здравого смысла. Вспомните, почему при сердечном приступе рекомендуется положить под язык валидол (имеется в виду рассасывать)? Или почему когда хочется пить, но нельзя (медицинская проблема), то рекомендуется держать воду во рту? Дело в том, что в ротовой полости и особенно под языком находится большое количество кровеносных сосудов, имеющих сильную проникающую способность. Если вещество позволяет, то оно способно таким образом сразу попасть в кровоток, минуя пищеварительную систему, где неизбежно некоторая часть веществ теряется. Добавки с низкомолекулярной ГК, имеющие высокую биосовместимость и усвояемость, хорошо пройдут таким путём и сразу попадут в кровь.

Большинство добавок, которые вы встретите, не предназначены для употребления таким способом. Если это комплексная добавка для суставов, то большинство веществ в них не рассасывают. Чистая ГК в порошке (капсулах) тоже для этого не предназначена. Да и рассасывать это всё каждый день не всем подойдёт. Сейчас надо, чтобы быстренько закинул в себя и побежал. Но добавку, предназначенную специально для потребления таким способом я нашёл. Если проходить курсами и пить гиалуроновую кислоту целенаправленно, то приобрести попробовать можно и такой препарат.

Hyalogic LLC , гиалуроновая кислота для суставов, кожи и глаз, 60 фруктовых жевательных пастилок

Две такие пастилки в день обеспечат организм достаточным количеством гиалуроновой кислоты. Но не увлекайтесь сильно, помните, что это всё-таки не конфеты.

Ещё один вопрос касается привыкания организма к поступающим дозам кислоты извне . Так как она везде одинакова, то организм не отторгает её, хорошо усваивает. А если кислота уже есть, то зачем вырабатывать свою? Если постоянно и много пить кислоты, то она может прекратить синтезироваться самостоятельно. Однозначного подтверждения этому нет. В одних источниках кислота, принимаемая дополнительно способствует лучшему синтезу своей собственной, в других наоборот. Но это тоже зависит от кислоты, способа и места её введения.

В любом случае, со всеми добавками гиалуроновой кислоты лучше делать перерывы, не пить постоянно и следовать рекомендациям надёжных производителей.

Виды и формы добавок с гиалуроновой кислотой. Что лучше и как выбрать?

Красота красотой, но добавки с гиалуроновой кислотой рекомендуются как ещё одно средство, восполняющее её недостаток там, где она должна быть всегда: хрящевая ткань, кожа, стекловидное тело глаз. При заболеваниях и проблемах (травмы, операции, нарушение обмена веществ) нарушается и нормальный естественный синтез её в этих местах. Чтобы помочь организму восполнить этот недостаток рекомендуется приём добавок.

Что касается самой кислоты, то производители чаще всего не оговаривают какая гиалуроновая кислота в составе их продукта: низкомолекулярная или высокомолекулярная, синтезированная или животного происхождения.

На нашей добавке от фирмы Эвалар я обнаружил упоминание о наличии высокомолекулярной и низкомолекулярной кислот. С одной стороны, как уже говорилось, смысла пить высокомолекулярную кислоту нет, она пролетит мимо, как фанера над Парижем. Но я не могу сказать, хорошая (вернее, насколько эффективна) эта добавка или нет. Смотря какого размера кислоту называть высокомолекулярной и низкомолекулярной. Но в нашей добавке количество кислоты в одной капсуле больше чем где бы то ни было. Пробуйте. Здесь уже только по ощущениям смотреть и по стоимости.

Могу только сказать: считается по умолчанию, что производители пищевых добавок используют низкомолекулярную нативная (естественную для организма) кислоту, полученную биотехнологическим способом. Принимать высокомолекулярную кислоту с добавками бессмысленно, она просто не усвоится организмом.

Для добавок во всём мире не оговорено конкретных правил и требований. С одной стороны, это правильно – это пищевой продукт, а не лекарство, с другой — не понятно, что там намешал производитель. Если не запрещено, то разрешено – суй что хочешь. Поэтому добавку и производителя надо выбирать серьёзно.

Первая группа добавок, содержащих гиалуроновую кислоту, содержит вещества хондропротекторного назначения (глюкозамин и хондроитин) и другие элементы, направленные на питание хрящевой и . В хрящевой ткани они работают все вместе на общее благо и зависят друг от друга.

Solgar, Глюкозамин, гиалуроновая кислота, хондроитин и МСМ, 120 таблеток

В большом количестве добавок такого типа содержится BioCell Collagen II.

BioCell Collagen II типа — это клинически испытанное, запатентованное, имеющее большую усвояемость и пользу для наших суставов вещество. Естественно, это коллаген животного происхождения, получаемый их куриных хрящей. Сами по себе хрящи являются местом наибольшей концентрации коллагеновых волокон, хондроитина и низкомолекулярной биодоступной гиалуроновой кислоты в соотношении: 65% — гидролизованного коллагена II типа, 20% — хондроитина сульфата и 10% — гиалуроновой кислоты. Если знаете английский язык и интересно, то можно посетить специализированный сайт www.biocellcollagen.com для более глубокого изучения.

К добавкам такого вида неплохо всё же добавить, для получения терапевтического эффекта, препарат именно гиалуроновой кислоты.

Solgar, Гиалуроновая кислота, 120 мг, 30 таблеток

Здесь также основное вещество BioCell Collagen , но в более высокой концентрации, поэтому гиалуроновой кислоты в одной таблетке содержится максимальная норма, ну и коллаген II типа для наших хрящей будет полезен. Предусмотрен и витамин С, необходимый для усвоения как коллагена, так и гиалуроновой кислоты. Не забыли?

Аналогичная добавка от другой известной фирмы в более выгодном отношении цены, качества, количества. Doctor"s Best, Best гиалуроновая кислота с хондроитин сульфатом, 180 вегетарианских капсул

Суперпопулярная и надёжная в плане качества компания Now Foods предлагает интересный продукт с содержанием хорошего количества гиалуроновой кислоты, витаминов и аминокислот в жидком виде. Естественно, это всё усвоится быстрее и лучше любых таблеток. Но хранить в холодильнике, не разливать, не бить.

Now Foods, Жидкая гиалуроновая кислота, ягодный вкус, 100 мг, 16 жидких унций (473 мл)

Если же вы предпочитаете как и я, опираясь на нормы, правила приёма и другие составляющие подбирать себе отдельные препараты в зависимости от нагрузок, наличия проблем или просто профилактики, то можно приобрести отдельно добавки с гиалуроновой кислотой.

California Gold Nutrition, Гиалуроновая кислота, 60 вегетарианских капсул

Now Foods, Гиалуроновая кислота, двойная сила, 100 мг, 120 капсул на растительной основе .

Итак, подведём итоги. Мы рассмотрели гиалуроновую кислоту просто со всех сторон: что это, зачем нужна, что делает и как делает. Я обычно даю конкретные препараты с учётом того, чтобы была понятна теория и чтобы показать по каким признакам, обладая определёнными знаниями, можно подобрать подходящий именно вам препарат. И эта статья, и многие другие, описывающие добавки для суставов универсальны: они содержат информацию по веществам и основные принципы, по которым следует выбирать препараты, что бы не выбрасывать зря деньги на ветер, а добавка принесла пользу.

Множество добавок и средств с гиалуроновой кислотой вы можете приобрести здесь . Их много и для любых целей: пить, мазать, глотать, разжёвывать и рассасывать.

Но самое главное, что вы, прочитав эту статью или любую другую в моем блоге, будете знать — как выбрать такие средства и не тратить бездумно деньги. Как приобрести то, что вам подойдёт и принесёт пользу.

Будьте здоровы и не болейте!

Структура

Молекула гиалуроновой кислоты похожа на длинную ленту, построенную из чередующихся сахаров - D-глюкуроновой кислоты и N-ацетилглюкозамина. образующих базовую дисахаридную единицу (рис. 1 ).

Рис.1. Гиалуроновая кислота состоит из чередующихся дисахаридных едениц

В одной цепочке может быть до 250 тысяч дисахаридных единиц. Молекулярная масса этого природного полисахарида достигает 10 тысяч кДа. ГК входит в состав синовиальной жидкости, стекловидного тела, встречается в пупочном канатике, роговице, костях, клапанах сердца, оболочках яйцеклеток.

Принципиально важным является свойство гиалуроновой кислоты (ГК) связывать и удерживать (за счет водородных связей) большое количество воды: 1 молекула ГК связывает 200-500 молекул воды. При этом она обладает эффектом «памперса» - не отдает воду даже при уменьшении ее содержания в окружающей среде. Высокая плотность отрицательных зарядов, образующихся при диссоциации карбоксильных (кислотных) групп, притягивает массу катионов, таких как ионы Na+, которые являются осмотически активными и обуславливают поступление в матрикс еще большего количества воды. Формирующееся при этом высокое давление набухания и есть то, что мы называем тургором. Тургор дермы, определяющийся содержанием и свойствами ГК, обеспечивает тургор .

Поскольку в молекуле есть как гидрофильные, так и гидрофобные участки, в растворах высокомолекулярная ГК (М.м > 1000 кДа) приобретает пространственную структуру в виде хаотично закрученной ленты, которая в трехмерном пространстве образует рыхлый клубок. Такие клубки занимают огромный объем (в тысячи раз больший, чем объем самих макромолекул!), образуя вязкий гель даже при очень низкой концентрации.

Формирующиеся пространственные сети с ячейками определенного размера обеспечивают «естественный отбор» циркулирующих молекул. Такое природное «молекулярное сито» свободно пропускает ионы, сахара, аминокислоты, сигнальные молекулы, но задерживает (и накапливает) большие молекулы, в том числе и различные токсины.

Метаболизм

Синтез ГК происходит на внутренней поверхности плазматической мембраны фибробластов. Молекулы моносахаров, из которых выстраивается полимерная цепочка, образуются из глюкозы, донором аминогруппы является глутамин. По мере формирования макромолекула выводится наружу (рис. 2 ).

Рис.2. Синтез гликозаминогликатов фибропластами (по H. Heine, 1997)

Синтез ГК катализируется ферментом гиалуронатсинтетазой (HAS), представленной тремя разновидностями (Itano N.):

HASi - осуществляет медленный синтез цепей с М.м около 200-2000 кДа,
HAS2 - отвечает за быстрый синтез высокомолекулярной ГК с М.м. более 2000 кДа),
HAS3 - самый активный из ферментов, участвующий в синтезе ГК с М.м. около 200-2000 кДа.

Гиалуроновой кислоты в дерме синтезируется намного больше, чем катаболизируется. Оказывается, значительная ее часть предназначена для дренирования через лимфатическую систему, что является важным механизмом детоксикации ткани, ведь вместе с ней удаляются «запутавшиеся» 8 молекулярных «сетях» экзо- и эндотоксины. В лимфатические сосуды способны проникать даже большие цепи ГК с М.м. около 1000 кДа.

Катаболизм ГК носит ступенчатый характер, и ему придается большое значение в регуляции состояния матрикса. В настоящее время биотрансформацию ГК рассматривают как важнейший фактор поддержания гомеостаза и один из универсальных механизмов развития патологических процессов (воспаления.опухолевой инвазии и метастазирования), ведь по мере уменьшения длины исходной цепочки образуются фрагменты с собственной биологической активностью (таблица 2 ).

Катаболизируется ГК с участием гиалуронидаз (I и II типа), катализирующих реакции гидролиза и деполимеризации (внеклеточная деградация). Мелкие фрагменты частично фагоцитируются макрофагами и подвергаются дальнейшему катаболизму с участием лизосомальных ферментов (3-глюкуронидазы и (3-ацетилглюкозаминидазы (внутриклеточная деградация). 90% ГК, попавшей в периферический лимфоток, разрушается в лимфоузлах, 9% - в эндотелиоцитах печени и 1% - в селезенке.

В организме взрослого человека весом 70 кг в составе всех органов и тканей суммарно содержится около 15 г гиалуроновой кислоты, причем 50% приходится именно на кожу.
Ежедневно около 5 г ГК разрушается и вновь синтезируется, то есть время «жизни» этой молекулы ограничивается несколькими днями. ГК - самый быстро обновляемый компонент внеклеточного матрикса. Для сравнения: «продолжительность жизни» зрелого коллагенового волокна - несколько месяцев, волокна эластина вообще относятся к практически необновляемым структурам.

Таблица 2. Биологические функции молекул гиалуроновой кислоты с различной молекулярной массой (Stern R et al, 2006)

Длинные цепи с М.м. около 500 кДа	Подавляют ангиогенез, препятствуют миграции и делению клеток, возможно за счет изменения межклеточного взаимодействия, ингибируют продукцию цитокина IL-1b, простагландина Е2, оказывают иммуносупрессивное действие.
Молекулы с массой 20-100 кДа	Стимулируют миграцию и деление клеток, способствуют заживлению ран, обеспечивают целостность эпителия, участвуют в овуляции и эмбриогенезе.
Короткие цепи ГК с М.м. менее 0.4-10 кДа	Стимулируют ангиогенез, оказывают иммуномодулирующее и противовоспалительное действие.
Тетрасахариды	Обладают антиапоптотическими свойствами, стимулируют синтез белков теплового шока.

ГК в жизни клеточного сообщества

ГК входит в состав не только , но и многих других органов и тканей. И на уровне всего организма регуляция ее биосинтеза фибробластами осуществляется нейроэндокринной системой. Важная роль принадлежит гормону передней доли гипофиза - соматотропину, который стимулирует деление и синтетическую активность клеток соединительной ткани. Кортикотропин и глюкокортикоиды (кортизон, гидрокортизон) угнетают деление фибробластов, способствуют их «ускоренному старению», что сопровождается уменьшением синтеза коллагена и гиалуроновой кислоты. Минералокортикоиды (альдостерон, дезоксикортикостерон), напротив, стимулируют образование ГК. Аналогичным эффектом обладают эстрогены (см. Приложение «ГК в организме человека: интересные факты»).

В дерме поддержание уровня ГК обеспечивается механизмами ауторегуляции по принципу обратной связи (схема 2 ).

Взаимодействие ГК с клетками происходит с участием специфичных белков- гиаладгеринов, которые могут быть как элементами рецепторного аппарата клеток (RHAMM, IHABP), так и внеклеточными структурами, к которым относятся верзикан, аггрекан, фибриноген, коллаген VI типа (см. Приложение «Взаимодействие ГК с рецепторами - механизм реализации ее биологической активности»).

На этом самом месте стоит, наверное, приостановиться и задуматься. С чем связано такое широкое распространение ГК в организме человека? И в животном мире вообще? Чем определяется многообразие механизмов регуляции ее метаболизма? Почему по мере деградации биологическая активность не исчезает, а видоизменяется? Обобщая все вышесказанное и заглядывая вперед, можно предположить: ответ кроется в многообразии биологических функций этого уникального биополимера (таблица 3 ).

Таблица 3 . Биологическая роль гиалуроновой кислоты

Является основой гидратированного межклеточного матрикса - физиологической среды для миграции, деления и дифференциации клеток.

Регулирует синтетическую активность фибробластов, в том числе и внеклеточный этап синтеза коллагена.

Оказывает опосредованное иммуномодулирующее действие (как стимулируя, так и подавляя иммунитет).

Обеспечивает транспорт питательных веществ и сигнальных молекул от кровеносных сосудов к клеткам, а также выведение продуктов жизнедеятельности.

Способствует дренажу и детоксикации соединительной ткани, является «ловушкой» для свободных радикалов.

Обеспечивает регенерацию тканей и репарацию повреждений (пластическая функция).

Участвует в регуляции ангиогенеза.

Регулирует морфогенез тканей в период эмбрионального развития.

ГК и старение

Вопрос о том, изменяется ли с возрастом содержание ГК в коже, остается дискуссионным. Однако известно точно, что по мере старения организма все большее количество ГК переходит из свободного состояния в связанное (с белками). При этом она частично утрачивает свои уникальные способности, а именно: ингибировать реакции свободно-радикального окисления, вовлекаться в метаболический путь и стимулировать фибробласты, привлекать и удерживать воду. За счет снижения содержания воды кожа теряет упругость, и ее гладкий рельеф деформируется морщинами и складками.

Гиалуронан (также называется гиалуроновой кислотой, гиалуронатом или ГК) представляет собой анионный, несульфатированный гликозаминогликан, широко распространенный по всем соединительной, эпителиальной и нервной тканям. Он является уникальным среди гликозаминогликанов в том, что он не сульфатирован, образуется в плазматической мембране вместо аппарата Гольджи, и может быть очень большим, с молекулярной массой, которая зачастую достигает миллионов. Являясь одним из главных компонентов внеклеточного матрикса, гиалуроновая кислота значительно способствует пролиферации и миграции клеток, а также может быть вовлечена в процессе роста некоторых злокачественных опухолей.

Структура гиалуроновой кислоты

Свойства гиалуроновой кислоты впервые были определены в 1930-х годах в лаборатории Карла Мейера.

Гиалуроновая кислота представляет полимер дисахаридов, состоящих из D-N-ацетилглюкозамина и D-глюкуроновой кислоты, соединенных поочередно β-1,4 и β-1, 3- гликозидными связями. Гиалуроновая кислота может содержать по 25000 подобных дисахаридных звеньев. Полимеры гиалуроновой кислоты могут варьироваться в размере от 5000 до 20000000 Да в естественных условиях. Средний молекулярный вес в синовиальной жидкости человека составляет 3-4 миллиона Да; гиалуроновая кислота, выделенная из человеческой пуповины имеет 3140000 Да.

Гиалуроновая кислота энергетически стабильна, отчасти из-за стереохимии составляющих ее дисахаридов. Громоздкие группы на каждой молекуле сахара находятся в пространственно приемлемых положениях, в то время как меньшие молекулы водорода выбирают менее благоприятные аксиальные позиции.

Биологический синтез

Гиалуроновая кислота синтезируется классом интегральных мембранных белков, называемых гиалуронан-синтазами, из которых в организме позвоночных содержатся 3 типа - HAS1, HAS2 и HAS3. Данные ферменты удлиняют гиалуроновую кислоту, последовательно добавляя N-ацетилглюкозамин и глюкуроновую кислоту к исходному полисахариду, при этом передавая полимер с помощью ABC-транспортера через клеточные мембраны в межклеточное пространство.

Было показано, что синтез гиалуроновой кислоты (HAS) ингибируется 4-метилумбеллифероном («химекромон», «хепарвит»), производным 7-гидрокси-4-метилкумарина. Это селективное ингибирование (без ингибирования других гликозаминогликанов) может оказаться полезным в предотвращении метастазирования клеток злокачественных опухолей.

Bacillus Subtilis недавно была генетически модифицирована (ГМО), чтобы культивировать формулу с выделением гиалуроновой кислоты, в запатентованном процессе производства продукции, предназначенной для людей.

Клеточные рецепторы для гиалуроновой кислоты

До сих пор клеточные рецепторы, которые были определены для гиалуроновой кислоты, подразделялись на три основные группы: CD44, рецептор для ГК-опосредованной подвижности (RHAMM) и внутриклеточные молекулы адгезии-1 (ICAM-1). CD44 и ICAM-1 уже были известны как молекулы адгезии клеток с другими признанными лигандами, прежде чем было обнаружено их ГК-связывание.

CD44 широко распространены по всему организму, и формальная демонстрация связывания HA-CD44 было предложено Aруффо и соавторами в 1990 году. На сегодняшний день, он признается в качестве основного рецептора на поверхности клетки для гиалуроновой кислоты. CD44 опосредует взаимодействие клеток с гиалуроновой кислотой и связывание обоих оказывает важное влияние в различных физиологических событиях, таких как агрегация клеток, миграция, пролиферация и активация; адгезия «клетка-клетка» и «клетка-субстрат»; эндоцитоз гиалуроновой кислоты, которая приводит к ее катаболизму в макрофагах; а также сборка околоклеточных матриксов из протеогликанов и гиалуроновой кислоты. Две значительные роли CD44 в коже были предложены Кая и соавторами. Первая заключается в регуляции пролиферации кератиноцитов в ответ на внеклеточные стимулы, а вторая - в поддержании местного гомеостаза гиалуроновой кислоты.

ICAM-1 известен в основном как метаболический рецептор клеточной поверхности для гиалуроновой кислоты, и этот белок может быть ответственным, в основном, за выделение кислоты из лимфы и плазмы крови, что составляет большую часть метаболизма всего организма. Связывание лиганда этого рецептора, таким образом, вызывает высоко скоординированный каскад событий, который включает в себя образование эндоцитотического пузырька, его слияние с первичными лизосомами, ферментативное расщепление до моносахаридов, активный трансмембранный транспорт этих сахаров в клеточный сок, фосфорилирование GlcNAc и ферментативное деацетилирование. Как и его название, ICAM-1 также может служить молекулой клеточной адгезии, и связывание гиалуроновой кислоты с ICAM-1 может способствовать контролю ICAM-1-опосредованной активации воспаления.

Расщепление гиалуроновой кислоты

Гиалуроновая кислота расщепляется семейством ферментов, называемых «гиалуронидазы». У людей есть, как минимум, семь видов гиалуронидазоподобных ферментов, некоторые из которых - опухолевые супрессоры. Продукты расщепления гиалуроновой кислоты, олигосахариды и гиалуронат с крайне низкой молекулярной массой, проявляют проангиогенные свойства. Также недавние исследования доказали, что фрагменты гиалуроновой кислоты, а не нативная высокая молекулярная масса, способны вызывать воспалительные реакции в дендритных клетках и макрофагах при повреждениях ткани и отторжении трансплантата кожи.

Роль гиалуроновой кислоты в процессе регенерации раны

Кожа служит механическим барьером к внешней среде и действует для предупреждения проникновения инфекционных агентов. После повреждения, нижележащие ткани подвержены инфицированию; таким образом, быстрое и эффективное заживление оказывает решающее значение для восстановления барьерной функции. Заживление ран кожи является очень сложным процессом, и включает в себя множество взаимодействующих процессов, инициированных гемостазом и высвобождением тромбоцитарных факторов. Следующие стадии - это воспаление, образование грануляционной ткани, реэпителизация и ремоделирование. Гиалуроновая кислота, вероятно, играет многогранную роль в опосредовании этих клеточных и матричных событий. Предполагаемые роли гиалуроновой кислоты в этой последовательности событий заживления ран кожи более подробно освещены ниже.

Воспаление

Многие биологические факторы, такие как факторы роста, цитокины, эйкозаноиды и др., образуются в процессе воспаления. Эти факторы являются необходимыми для последующих стадий заживления ран вследствие их ролей в содействии миграции воспалительных клеток, фибробластов и эндотелиальных клеток в месте раны.

Ткань раны в начале воспалительной фазы заживления раны изобилует гиалуроновой кислотой, что вероятно, является отражением усиленного синтеза. Гиалуроновая кислота действует как промоутер раннего воспаления, что имеет решающее значение в целом для процесса заживления раны кожи. В мышиной модели воздушного кармана, в процессе каррагинан/IL-1-индуцированного воспаления, отмечалось, что гиалуроновая кислота усиливает клеточную инфильтрацию. Кобаяши и соавторы показали дозозависимое увеличение про-воспалительных цитокинов TNF -α и производство IL-8 фибробластами человеческой матки в концентрации гиалуроновой кислоты 10 мкг/мл до 1 мг/мл через CD44-опосредованный механизм. Эндотелиальные клетки, в ответ на воспалительные цитокины, такие как TNF-α, и бактериальный липополисахарид, также синтезируют гиалуроновую кислоту, что, как было показано, усиливает первичную адгезию цитокин-активированных лимфоцитов, экспрессирующих ГК-связывающие варианты CD44 в условиях ламинарного и статического потока. Интересно отметить, что гиалуроновая кислота имеет противоречивые двойные функции в воспалительном процессе. Она не только может способствовать воспалению, как утверждалось выше, но также может смягчить воспалительную реакцию, которая может способствовать стабилизации грануляционной ткани матрикса, как описано в следующей части.

Грануляция и организации матрикса грануляционной ткани

Грануляционная ткань является хорошо кровоснабжаемой, волокнистой соединительной тканью, которая замещает фибриновые сгустки в заживающих ранах. Она обычно растет от основания раны и может заполнить раны практически любого размера. Гиалуроновая кислота содержится в изобилии в грануляционной ткани матрикса. Множество различных функций клеток, которые существенно необходимы для восстановления тканей, можно приписать этой сети, богатой гиалуроновой кислотой. Эти функции включают усиление миграции клеток в предварительный матрикс раны, клеточной пролиферации и организации матрикса грануляционной ткани. Безусловно, инициация воспаления является чрезвычайно важной для образования грануляционной ткани, поэтому про-воспалительная роль гиалуроновой кислоты, как обсуждалось выше, также способствует этой стадии заживления раны.

Гиалуроновая кислота и миграция клеток

Миграция клеток имеет важное значение для образования грануляционной ткани. В ранней стадии грануляционной ткани преобладает внеклеточный матрикс, богатый гиалуроновой кислотой, которая считается благоприятной средой для миграции клеток в этот временный матрикс раны. Содействие гиалуроновой кислотой миграции клеток можно отнести к ее физико-химическим свойствам, как указано выше, а также ее прямому взаимодействию с клетками. По прежнему сценарию, гиалуроновая кислота представляет собой открытый гидратированный матрикс, который усиливает миграцию клеток, тогда как в последнем сценарии, управляемая миграция и контроль локомоторных механизмов клеток опосредуются через специфическое взаимодействие клеток между гиалуроновой кислотой и поверхностными ГК-рецепторами клеток.

Как уже говорилось ранее, тремя основными поверхностными рецепторами клеток для гиалуроновой кислоты являются CD44, RHAMM, и ICAM-1. RHAMM больше связан с миграцией клеток. Он образует связи с несколькими протеинкиназами, связанных с локомоцией клеток, например, протеинкиназа (ERK), регулируемая внеклеточным сигналом, p125fak, и pp60c-src. Во время внутриутробного развития, пути миграции, через которые мигрируют клетки нервного гребня, богаты гиалуроновой кислотой. Гиалуроновая кислота тесно связана с процессом миграции клеток в матриксе грануляционной ткани, и исследования показывают, что движение клетки может быть ингибировано, по крайней мере, частично, расщеплением гиалуроновой кислоты или блокированием занятости ГК-рецепторов.

Обеспечивая клетку динамической силой, синтез гиалуроновой клетки, как было показано, связывается с миграцией клеток. В основном, кислота синтезируется на плазматических мембранах и выделяется прямо во внеклеточную среду. Это может содействовать гидратированному микроокружению в местах синтеза, и имеет важное значение для миграции клеток, так как способствует отделению клеток.

Роль гиалуроновой кислоты в ведении воспалительной реакции

Хотя воспаление является неотъемлемой частью образования грануляционной ткани, для нормального восстановления тканей, чтобы продолжить, воспаление должно управляться. В первоначально образовавшейся грануляционной ткани процесс воспаления является очень интенсивным с высокой скоростью метаболизма ткани, опосредованным ферментами, расщепляющих матрикс и реактивными метаболитами кислорода, которые являются продуктами воспалительных клеток.

Стабилизация матрикса грануляционной ткани может быть достигнута путем модерирования воспаления. Гиалуроновая кислота функционирует в качестве важного модератора в этом процессе, что противоречит ее роли в воспалительной стимуляции, как описано выше. Гиалуроновая кислота может защитить от вредного воздействия свободных радикалов на клетки. Это благодаря свойству очистки от свободных радикалов, физико-химическому свойству, разделяемому полиионными крупными полимерами. В крысиной модели свойства очистки от свободных радикалов, исследованной Фоши и его коллегами, было показано, что гиалуроновая кислота уменьшает повреждение грануляционной ткани.

В дополнение к роли очистки от свободных радикалов, гиалуроновая кислота может также функционировать в отрицательной обратной связи воспалительной активации через свои специфические биологические взаимодействия с биологическими компонентами воспалениия. TNF-α, важный цитокин, образующийся при воспалении, стимулирует экспрессию TSG-6 (TNF-стимулированный ген 6) в фибробластах и воспалительных клетках. TSG-6, ГК-связывающий белок, также образует стабильный комплекс с сывороточным ингибитором протеиназы IαI (Inter-α-ингибитор) с синергетическим эффектом на плазмин-ингибирующей активности последнего. Плазмин участвует в активации протеолитического каскада матричных металлопротеиназ и других протеиназ, ведущих к воспалительному повреждению тканей.

Таким образом, действия комплекса TSG-6 / IαI, которые могут быть дополнительно организованы путем связывания с гиалуроновой кислотой во внеклеточном матриксе, могут служить мощной отрицательной обратной связью, чтобы смягчить воспаление и стабилизировать грануляционную ткань по мере прогрессирования заживления. В мышиной модели воздушного кармана каррагинан/IL-1 (интерлейкин-1β)-индуцированного воспаления, где гиалуроновая кислота, как было показано, имеет провоспалительные свойства, уменьшение воспаления может быть достигнуто путем введения TSG-6, и результат сравним с системным лечением дексаметазоном.

Реэпителизация

Гиалуроновая кислота играет важную роль в нормальном эпидермисе. Гиалуроновая кислота также имеет важные функции в процессе реэпителизации в связи с ее несколькими свойствами. Она служит в качестве неотъемлемой части внеклеточного матрикса базальных кератиноцитов, которые являются основными составляющими эпидермиса, ее функция очистки от свободных радикалов и ее роли в пролиферации и миграции кератиноцитов.

В нормальной коже, гиалуроновая кислота находится в относительно высокой концентрации в базальном слое эпидермиса, где находятся пролиферирующие кератиноциты. CD44 находится совместно с гиалуроновой кислотой в базальном слое эпидермиса, где дополнительно, как было показано, экспрессируется преимущественно на плазматических мембранах, стоящих перед карманами матрикса, богатого кислотой. Поддержание внеклеточного пространства и обеспечение открытой, а также увлажненной, структуры для прохождения питательных веществ, являются основными функциями гиалуроновой кислоты в эпидермисе.

Тамми Р. и его коллеги обнаружили увеличение содержания гиалуроновой кислоты в присутствии ретиноевой кислоты(витамина А). Предполагаемые эффекты ретиноевой кислоты против повреждения светом и старения кожи могут коррелироваться, по крайней мере частично, с увеличением содержания гиалуроновой кислоты в коже, что приводит к увеличению гидратации тканей. Было высказано предположение, что свойство очистки от свободных радикалов гиалуроновой кислоты вносит свой вклад в защиту от солнечного излучения, поддерживая роли CD44, выступающим в качестве ГК-рецепторов в эпидермисе.

Эпидермальная гиалуроновая кислота также функционирует в роли манипулятора в процессе пролиферации кератиноцитов, что крайне важно в нормальном функционировании эпидермиса, а также во время реэпителизации в восстановлении тканей. В процессе заживления раны, гиалуроновая кислота экспрессируется в крае раны, в матриксе соединительной ткани, и выстраиваясь согласно экспрессии CD44 в миграции кератиноцитов.

Kая и соавторы нашли подавление экспрессии CD44 эпидермис-специфичным антисенсорным трансгеном, приведшему у животных накоплению дефектной гиалуроновой кислоты в поверхностной дерме, сопровождаемому различными морфологическими изменениями базальных кератиноцитов и дефектной пролиферации кератиноцитов в ответ на митоген и факторы роста. Также наблюдались снижение эластичности кожи, нарушенная местная воспалительная реакция и нарушенная регенерация тканей. Их наблюдения решительно поддерживают важные роли гиалуроновой кислоты и CD44 в физиологии кожи и регенерации тканей.

Заживление ран и рубцевание у плода

Отсутствие фиброзного рубцевания является основной особенностью заживления ран плода. Даже в течение длительного времени, содержание гиалуроновой кислоты в ранах плода по-прежнему выше, чем в ранах взрослых, что дает повод предполагать, что кислота может, по крайней мере, частично, уменьшить отложение коллагена, что следовательно, приводит к сниженному рубцеванию. Это предложение согласуется с исследованием Веста и его коллег, которые показали, что в заживлении ран взрослых и плода на поздних сроках беременности, удаление гиалуроновой кислоты приводит к фиброзному рубцеванию.

Видео о гиалуроновой кислоте

Роль в метастазировании рака

Синтазы гиалуроновой кислоты (СГК) играют роль на всех стадиях метастазирования рака. Производя анти-адгезивную гиалуроновую кислоту, СГК может позволять опухолевым клеткам освобождаться от основной массы опухоли, и если кислота связывается с рецепторами, такими как CD44, активация Rho GTPаз может способствовать эпителиально-мезенхимальному переходу раковых клеток. Во время процесса интравазации или экстравазации взаимодействие гиалуроновой кислоты, выделенной СГК с рецепторами, такими как CD44 или RHAMM, усиливают изменения в клетках, которые позволяют раковым клеткам проникать в сосудистую или лимфатическую системы. Во время путешествия в этих системах, гиалуроновая кислота, выделенная СГК, защищает раковые клетки от физического повреждения. Наконец, в формировании метастатического поражения, СГК производит гиалуроновую кислоту, чтобы позволить раковым клеткам взаимодействовать с родными клетками на вторичном участке и производить опухоль самой по себе.

Гиалуронидазы (ГКазы или ГИАЛ) также играют множество ролей в метастазировании рака. Помогая расщеплять внеклеточный матрикс, окружающий опухоль, гиалуронидазы помогают раковым клеткам отделиться от первичной массы опухоли и играют важную роль в интравазации, способствуя расщеплению базальной мембраны лимфатических или кровеносных сосудов. Гиалуронидазы вновь играют эти роли в обосновании метастатического образования, помогая с экстравазацией и удалением внеклеточного матрикса с вторичного участка. Наконец, гиалуронидазы играют ключевую роль в процессе ангиогенеза. Фрагменты гиалуроновой кислоты усиливают ангиогенез и гиалуронидазы производят эти фрагменты. Интересно, что гипоксия также усиливает продукцию гиалуроновой кислоты и активность гиалуронидаз.

Рецепторы гиалуроновой кислоты, CD44 и RHAMM, наиболее хорошо изучены с точки зрения их ролей в метастазировании рака. Усиленная клиническая экспрессия CD44 положительно коррелировалась с метастазированием в ряде типов опухолей. С точки зрения механики, CD44 влияет на адгезию раковых клеток друг с другом и к эндотелиальным клеткам, перестраивает цитоскелет посредством Rho GTPаз, и усиливает активность ферментов, расщепляющих внеклеточный матрикс. Увеличение экспрессии RHAMM также было клинически скоррелировано с метастазированием рака. С точки зрения механики, RHAMM способствует подвижности раковых клеток через ряд путей, включая киназу очаговой адгезии (FAK), МАР-киназу (МАРК), PP60 (c-src), и ниже по течению мишени Rho-киназы (ROK). RHAMM также может сотрудничать с CD44 с целью содействовать ангиогенезу в сторону метастатического образования.

Применение гиалуроновой кислоты в медицине

Гиалуроновая кислота содержится во многих тканях организма, таких как кожа, хрящи и стекловидное тело. Таким образом, она хорошо подходит для биомедицинских приложений, нацеленных на эти ткани. Первый биомедицинский продукт гиалуронана, «Healon», был разработан в 1970 - 1980-х годах компанией «Pharmacia» и был предназначен для использования в хирургии глаза (например, пересадка роговицы, операции по удалению катаракты, операции при глаукоме, и операции по восстановлению отслоившейся сетчатки). Другие биомедицинские компании также производят бренды гиалуроновой кислотой для глазной хирургии.

Нативная гиалуроновая кислота имеет сравнительно короткий период полураспада, так что были привлечены различные методы производства для увеличения длины цепи и стабилизации молекулы для применения в медицинских целях. Введение перекрестных связей на основе белка, введение молекул, очищающих от свободных радикалов, таких как сорбитол, и минимальная стабилизация цепей гиалуроновой кислоты с помощью химических реактивов, например, стабилизация NASHA - это все методы, которые были использованы.

В конце 1970-х годов имплантация интраокулярного хрусталика часто сопровождалась тяжелым отеком роговицы, вследствие повреждения клеток эндотелия во время операции. Было очевидно, что требовалась вязкая, прозрачная, физиологическая смазка для предотвращения такого соскабливания эндотелиальных клеток. Эндре Балаш запатентовал метод выделения гиалуроновой кислоты, физиологический смазки (которую он назвал «Healon») из гребней петухов в начале 1970-х годов.

Во-первых, Балаш считал «Healon» невоспалительным заменителем стекловидного тела. Клаус Дольман использовал «Healon» Балаша в одном случае, в котором произошло уплощение передней камеры после сложной пересадки роговицы. Хотя можно представить, что вязкая гиалуроновая кислота может привести к увеличению внутриглазного давления, Дольман сообщил об отсутствии такого увеличения. С того времени Балаш получил лицензию на процесс синтеза компанией Pharmacia, шведской фармкомпанией.

Гиалуроновая кислота [ГК] найдена во внеклеточном матриксе позвоночных тканей, в поверхностном покрытии определенных видов Streptococcus и болезнетворных бактериальных микроорганизмов Pasteurella, а также на поверхности некоторых частично пораженных вирусом морских водорослей. Синтазы гиалуроновой кислоты [ГКС], это ферменты, которые полимеризуют ГК, используя UDP-сахарные предшественники, которые найдены во внешних мембранах этих организмов. Были идентифицированы гены ГКС из всех вышеупомянутых источников. Кажется, существуют два отличных класса ГКС, что основано на различиях в аминокислотной последовательности, предсказанной топологии в мембране и предполагаемом механизме реакции.

Все ГКС были определены как синтазы класса I, за исключением ГКС у вида Pasteurella. Был также объяснен каталитический способ работы единственной ГКС класса II (пмГКС). Этот фермент удлиняет внешние ГК-присоединяемые олигосахаридные акцепторы путем добавления индивидуальных моносахаридных единиц к неуменьшающемуся концу, чтобы сформировать длинные полимеры in vitro; ни одна ГКС класса I не имеет такой способности. Способ и направление полимеризации ГК, катализируемой ГКС класса I, остаются неясными. Фермент пмГКС также был проанализирован на предмет двух имеющихся у него активностей: GlcUA-трансферазной и GlcNAc-трансферазной. Таким образом, два активных участка существуют в одном пмГКС полипептиде, опровергая широко принятую догму гликобиологи: "один фермент - один модифицированный сахар". Предварительные свидетельства позволяют предполагать, что у ферментов класса I может также быть два участка активности.

Каталитический потенциал фермента пмГКС может использоваться, чтобы создать новые полисахариды или проектировать олигосахариды. Из-за множества потенциальных ГК-базирующихся медицинских методов лечения, эта хемоэнзиматическая технология обещает принести пользу на пути нашего стремления к хорошему здоровью.

Ключевые слова

Гиалуроновая кислота (ГК), хондроитин, гликозилтрансфераза, синтаза, катализ, механизм, химерные полисахариды, монодисперсные олигосахариды

Введение

Гиалуронан [ГК] - очень богатый глюкозаминогликан в организме позвоночных, имеющий и структурную, и сигнальную роли. Определенные патогенные бактерии, а именно, группы А и С вида Streptococcus и тип А Pasteurella multocida, производят внеклеточный покрывающий ГК, называемый капсулой. У обоих видов ГК капсула и является фактором ядовитости, который обеспечивает бактериям сопротивляемость фагоцитам и комплементарность. Другой организм, производящий ГК - это морская водоросля хлорелла, инфицированная определенным большим двухцепочечным ДНКовым вирусом PBCV-1. Роль ГК в жизненном цикле этого вируса пока не ясна на данный момент.

Иллюстрация 1. Реакция биосинтеза ГК.

Ферменты класса гликозилтрансфераз, которые полимеризируют ГК, называются ГК-синтазами (или ГКС), по старой терминологии, включающей также ГК-синтетазы. Все известные ГК-синтазы - это разновидности одного полипептида, ответственные за полимеризацию цепи ГК. UDP-сахарные предшественники, UDP-GlcNAc и UDP-GlcUA используются ГК-синтазами в присутствии двухвалентного катиона (Mn и/или Mg) при нейтральном pH (рис. 1). Все синтазы являются мембранносвязанными белками в живой клетке и обнаружены в мембранной фракции после лизиса клеток.

Между 1993 - 1998 были идентифицированы и клонированы на молекулярном уровне ГК-синтазы групп A и С Streptococcus [спГКС и сеГКС соответственно], ГК-синтазы позвоночных животных [ГКС 1,2,3], ГК-синтаза водорослевого вируса [свГКС], а также ГК-синтаза типа A вида Pasteurella multocida [пмГКС]. Первые три типа ГК-синтаз, кажется, очень похожи в размере, аминокислотной последовательности и предсказанной топологии в мембране. ГК-синтаза вида Pasteurella, напротив, больше и обладает существенно отличающейся от других синтаз последовательностью и предсказанной топологией. Поэтому, мы предположили существование двух классов ГК-синтаз (таблица 1). Ферменты класса I включают стрептококковые, позвоночные и вирусные белки, в то время как белок вида Pasteurella в настоящее время единственный член класса II. У нас также есть некоторые свидетельства того, что каталитические процессы ферментов класса I и класса II отличаются.

Таблица 1. Два класса ГК-синтаз:

Хотя ГК-синтаза вида Pasteurella был последним обнаруженным ферментом из всех, некоторые особенности пмГКС способствовали существенному продвижению в его изучении в сравнении с некоторыми членами ферментов класса I, которые исследовались четыре десятилетия. Ключевая особенностью пмГКС, которая позволила разъяснить молекулярное направление полимеризации и идентификацию ее двух активных участков - это способность пмГКС удлиннять внешне расположенный акцепторный олигосахарид. Рекомбинантная пмГКС добавляет одиночные моносахариды повторным способом к ГК-ассоциированному олигосахариду in vitro. Внутренняя особенность каждой передачи моносахарида ответственна для того, чтобы формировать альтернативное повторение дисахаридов в этом глюкозаминогликане; одновременное формирование дисахаридной единицы не требуется. С другой стороны, никакое подобное удлиннение внешних акцепторов не было доказано ни для какого фермента класса I. Через фундаментальное научное исследование мы теперь развили некоторые биотехнологические применения замечательного белка класса ГК-синтаз вида Pasteurella.

Материалы & методы

Реагенты

Все реактивы для молекулярнобиологических исследований без специальной пометки были от Promega. Стандартные олигонуклеотиды были от Great American Gene Company. Все другие реактивы высокой чистоты, если иначе не отмечено, были от Sigma или от Fisher.

Усечение пмГКС и точечные мутанты

Был произведен ряд усеченных полипептидов, путем амплификации pPm7А вставки методом полимеразной цепной реакцией с Taq-полимеразой (Fisher) и синтетическими олигонуклеотидными праймерами, соответствующими различным частям пмГКС, с открытой рамкой считывания. Ампликоны затем были клонированы в плазмиду для экспрессии pKK223-3 (tac промотор, Pharmacia). Получившимися рекомбинантными конструкциями были трансформированы клетки Escherichia coli штамма TOP 10F" (Invitrogen) и выращены на среде LB (Luria-Bertani) с ампициллиновой селекцией. Мутации были сделаны, используя метод QuickChange сайт-направленного мутагенеза (Stratagene) с плазмидой pKK/пмГКС как ДНК шаблон.

Приготовление фермента

Для приготовления мембраны, содержащей рекомбинантный пмГКС полной длины, пмГК1-972 был изолирован из E.coli, как описано. Для растворимых усеченных пмГКС белков, пмГКС1-703, пмГКС1-650 и пмГКС1-703 - содержащих мутантов, клетки были извлечены с помощью В-PerТМ II Bacterial Protein Extraction Reagent (Pieree) согласно инструкции производителя, за исключением того, что процедура была выполнена при 7°C в присутствии ингибиторов протеаз.

Ферментные пути полимеризации ГК. GlcNAc модификация или GlcUA модификация

Три варианта было разработано, чтобы обнаружить происходит ли (а) полимеризация длинных цепей ГК или (b) добавление одиночного GlcNAc к GlcUA-конечному акцепторному олигосахариду ГК , или (c) добавление одиночного GlcUA к GlcNAc-конечному акцепторному олигосахариду ГК . Полная активность ГКС была оценена для раствора, содержащего 50 mM Tris, pH 7.2, 20 mM MnCl2, 0.1 M (NH4)2SO4, 1 M этиленгликоля, 0.12 mM UDP-(14C)GlcUA (0.01 μCi; NEN), 0.3 mM UDP-GlcNAc и различный набор ГК олигосахаридов, полученный из тестикул путем обработки гиалуронидазой [(GlcNAc-GlcUA)n, n= 4-10] при 30°C в течение 25 минут в объеме реакционной смеси 50 мкл. GlcNAc-трансферазная активность была оценена в течение 4 минут в той же буферной системе с различным набором ГК олигосахаридов, но только с одним сахаром в роли предшественника - 0.3 mM UDP-(3H)GlcUA (0.2 μCi; NEN). GlcUA-трансферазная активность была оценена в течение 4 минут в той же самой буферной системе, но только с 0.12 mM UDP-(14C)GlcUA (0.02 μCi) и с нечетным набором ГК олигосахаридов (3.5 мкг уроновой кислоты), приготовленных при помощи воздействия ацетата ртути на ГК-лиазу Streptomyces. Реакции были прекращены путем добавления SDS до 2% (w/v). Продукты реакции были отделены от субстратов путем бумажной (Whatman 3M) хроматографии с этанолом/1 М сульфат аммония, pH 5 5, как основной растворитель (65:35 для ГКС и оценки GlcUA-Tase; 75:25 для оценки GlcNAc-Tase). Для оценки ГКС образец бумажной полосы был промыт водой, и объединение радиоактивных сахаров в полимер ГК было обнаружено по сцинтилляции жидкости, рассчитанной при помощи BioSafe II коктейля (RPI). Для реакций полуиспытания образец и расположенные вниз по течению 6 см полосы были посчитаны по частям в 2 см. Все оценочные эксперименты были просчитаны таким образом, чтобы быть линейными относительно времени инкубации и концентрации белка.

Гель-фильтрационная хроматография

Размер ГК полимеров был проанализирован хроматографически на колонках Phenomenex PolySep-GFC-P 3000, элюция производилась 0.2 M нитратом натрия. Колонка была стандартизована флуоресцентными декстранами различного размера. Радиоактивные компоненты были обнаружены с помощью датчика LB508 Radioflow (EG & G Berthold) и коктейля Zinsser. По сравнению с полной оценкой ГКС, используя бумажную хроматографию, описанную выше, эти 3-минутные реакции содержали дважды UDP-сахарные концентрации, 0.06 μCi UDP-(14C)GlcUA и 0.25 нанограмма ряда ГК олигосахаридов. Кроме того, использовалось добавление кипящего (2 минуты) этилендиамина тетрациловой кислоты (финальная концентрация 22 mM), чтобы закончить реакции вместо добавления SDS.

Результаты и обсуждение

Утилизация и специфичность акцептора ГКС

Некоторые олигосахариды были проверены, в качестве акцепторов для рекомбинантного пмГКС1-972(Таблица 2). ГК олигосахариды были получены из тестикул путем гиалуронидазного щепления, а удлиннены пмГКС с помощью доставляемых подходящих UDP-сахаров. Восстановление борогидратом натрия не нарушает активность акцептора. С другой стороны, олигосахариды, полученные из ГК при помощи отщепления лиазой, не поддерживают удлиннение; дегидратированные ненасыщенные невосстановленные концевые остатки GlcUA нуждаются в гидроксильных группах, которые смогли бы присоединить входящий сахар из UDP-предшественника. Поэтому пмГКС-катализируемое удлиннение происходит в случае невосстановленных концевых групп. В ряде параллельных экспериментов было обнаружены рекомбинантные формы синтаз класса I - спГКС и х1ГКС, которые не удлинняют ГК-получаемые акцепторы. Принимая во внимание направление активности ферментов класса I, противоречивые сообщения были сделаны и необходимы дальнейшие исследования.

Таблица 2. Специфика олигосахаридных акцепторо пмГКС:

Интересно, что хондроитин сульфат пентамер является хорошим акцептором для пмГКС. Другие структурно связанные олигосахариды такие, как хитотетроза или хепарозан пентамер, однако, не служат акцепторами для пмГКС. В целом, пмГКС, кажется, требует, β-связанных GlcUA-содержащих акцепторных олигосахаридов. Мы выдвигаем гипотезу, что участок связывания олигосахаридов промежуточен в цепи удерживания ГК во время полимеризации.

Молекулярный анализ активности пмГКС трансферазы: два активных участка в одном полипептиде

Возможность измерить два компонента гликозилтрансферазной активности ГК синтазы, GlcNAc-трансфераза и GlcUA-трансфераза, позволил молекулярный анализ пмГКС. Мы отметили, что короткий дублированный мотив последовательности: Asp-Gly-Ser (Аспарагиновая к-та-Глицин-Серин), присутствовал в пмГКС. Из анализа сравнения гидрофобных групп многих других гликозилтрансфераз, которые производят β-связанные полисахариды или олигосахариды предположили, что вообще, существует два типа доменов: области "A" и "Б". ПмГКС, синтаза класса II, тем и уникальна, что содержит два "А" домена (личная коммуникация, B.Henrissat). Было предложено, что определенные члены класса I ГК синтаз (спГКС) содержат одиночные "А" и одиночные "Б" области. Различное удаление или точечные мутанты пмГКС были оценены для их способности полимеризовать ГК цепи или их способность добавлять одиночный сахар к ГК акцепторному олигосахариду (Таблица 3). Суммируя сказанное, пмГКС содержит два отличных друг от друга активных участка. Мутагенез аспартата мотива DGS (остаток 196 или 477) по обоим сайтам приводи к потере ГК полимеризации, но активность другого сайта оставалась относительно незатронутой. Таким образом, двойная активность ГК синтазы была преобразована в два различных одиночных действия гликозилтрансферазы.

Таблица 3. Активность пмГКС с удаленным участком или точечной мутацией.

Удаление последних 269 остатков от конечной карбоксильной группы преобразовало слабо выраженный мембранный белок в хорошо выраженный растворимый. Рассмотрение аминокислотной последовательности белка пмГКС в этой области, однако, не показывает типичных особенностей вторичной структуры, которые обеспечили бы прямое взаимодействие фермента с двойным слоем липида. Мы выдвигаем гипотезу, что конечная карбоксильная группа каталитического фермента пмГКС стыкуется с направляющим мембраносвязанным полисахарида транспортного аппарата живущей бактериальной клетки.

Первая "A" область пмГКС, А1, является GlcNAc-тазой, в то время как вторая "A" область, A2, является GlcUA-тазой (рис. 2). Это - первая идентификация двух активных участков для фермента, который производит гетерополисахарид, так же как ясное доказательство, что один фермент может действительно передать два различных сахара. Отличный от типа F фермент вида P. multocida, названный пмЦС, был найден, и вяснено, что он катализирует формирование несульфатируемого полимера хондроитина. ГК и хондроитин идентичны в структуре, за исключением упомянутого выше полимера, который содержит N-ацетилглюкозамин вместо GlcNAc. И пмГКС, и пмЦС на 87 % идентичны на уровне аминокислот. Большинство изменений в остатках находятся в области А1, что вполне совместимо с гипотезой о том, что эта область ответственна за передачу гексозамина.

Иллюстрация 2. Схематическое изображение пмГКС областей.
Два независимых трансферазных домена, А1 и A2, ответственны за катализ полимеризации цепи ГК. Повторяющиеся последовательные добавления одиночных сахаров быстро строят цепь ГК. Похоже, что карбоксильный конец пмГКС некоторым способом взаимодействует с мембранносвязанным транспортным аппаратом бактериальной клетки.

Иллюстрация 3. Модель биосинтеза ГК при помощи пмГКС.
Одиночные сахара добавляются к каждому "A" домену повторным способом к невосстанавливающемуся концу цепи ГК. Внутренняя точность каждой стадии активности трансферазы поддерживает повторение структуры дисахаридов ГК. Возникающая цепь ГК вероятно сохраняется пмГКС во время катализа через олигосахарид-связывающий участок.

Мы продемонстрировали эффективную передачу одиночного сахара с помощью пмГКС in vitro несколькими типами экспериментов, поэтому, мы выдвинули гипотезу, что цепи ГК формируются быстрым, повторяющимся добавлением одиночного сахара синтазой класса II (рис. 3). К настоящему времени, одна линия свидетельства предполагает, что фермент класса I также обладает двумя участками трансферазы. Мутация лейцинового остатка 314 на валин в ммГКС1, в части предварительного участка GlcUA-тазы, как сообщали, преобразовала эту ГКС позвоночного животного в хито-олигосахаридную синтазу. Ни один участок с соответствующей активностью GlcNAc-трансферазы не был идентифицирован.

Прививание полимера полисахаридными синтазами: добавление ГК к молекулам или твердым частицам

Исследование пмГКС в научно-исследовательской лаборатории преобразовало представления о ГК синтазах от царства трудных, упорных животноподобных чудовищ до потенциальных биотехнологических рабочих лошадок. Новые молекулы могут быть сформированы, используя способность пмГКС привить длинные цепи ГК на коротких ГК полученных цепях или хондроитин-производных акцепторах. Например, полезные акцепторы могут состоять из маленьких молекул или лекарств с ковалентно связанной ГК или хондроитин-олигосахаридные цепи (длиной в 4 сахара, например). В другом случае, цепи ГК могут быть добавлены к олигосахаридному праймеру, иммобилизованному на твердой поверхности (таблица 4). Таким образом, длинные цепи ГК могут быть мягко добавлены к чувствительным веществам или тонким устройствам.

В другом приложении, новые химерные полисахариды могут быть сформированы потому, что использование пмГКС олигосахаридным акцептором не столь же строго, как сахаридная трансферазная специфика. Хондроитин и хондроитин-сульфат признаны как акцепторы пмГКС и удлинняются ГК цепью различных длин (рис. 4). Наоборот, пмЦС очень гомлогичная хондроитин синтазе, распознает и удлинняет ГК акцепторы цепями хондроитина. Химерные молекулы глюкозаминогликана сформированы, содержа естественные, определенного соединения связи. Эти привитые полисахариды могут служить, чтобы присоединиться к клетке или ткани, которая связывает ГК с другой клеткой или ткань, связывающей хондроитин или хондроитин-сульфат. В определенных аспектах, привитые глюкозаминогликаны напоминают протеогликаны, которые являются существенными компонентами матрикса в тканях позвоночных. Но так как никакие компоновщики белка не присутствуют в химерных полимерах, то антигенность и проблемы протеолизиса, возникающие вокруг медицинского использования протеогликанов, устранены. Риск передачи инфекционных агентов тканями, извлеченными из животных, человеческому пациенту также уменьшен при использовании химерных полимеров.

Таблица 4. ПмГКС-инициированное прививание ГК на бусинки полиакриламида. Реакционная смесь содержит пмГКС, несущий радиоактивную метку UDP-(14C)GlcUA и UDP-(3H)GlcNAc, а также различные иммобилизованные праймеры сахаров (акцепторы, соединенные восстановительным аминированием в аминобусины) были представлены. Бусинки были промыты и радиоактивно инкорпорированы на другие бусины, измеренные методом расчета жидкостной сцинтилляции. ГК цепи были привиты на пластиковые бусины при использовании подходящего праймера и пмГКС.

Иллюстрация 4. Схематическое изображение привитых полисахаридных структур. ГК синтаза вида Pasteurella или хондроитин синтаза будут удлиннять определенные другие полимеры на невосстанавливающемся конце in vitro, чтобы сформировать новые химерные глюкозаминогликаны. Изображены некоторые примеры.

Синтез монодисперсной ГК и ГК-связанных олигосахаридов

В дополнение к добавлению большой полимерной ГК цепи к молекулам акцептора, пмГКС синтезируют определенные меньшие ГК олигосахариды в диапазоне от 5 до 24 сахаров. Используя фермент дикого типа и различные условия реакции, был относительно легко получен ГК олигосахарид, содержащий 4 или 5 моноахаридов, удлиненных несколькими сахарами до более длинных версий, которые очень часто трудно получить в больших количествах. Мы выяснили, что, комбинируя растворимый мутант GlcUA-Tase и растворимый мутант GlcNAc-Tase в той же самой смеси реакции позволяет формирование ГК полимера, если система снабжена акцептором. В течение 3-х минут была сделана цепь из примерно 150 сахаров (-30 кДа). Любая одиночная мутант-синтаза не сформирует в результате цепь ГК. Поэтому, если дальнейший контроль реакции сделан путем выборочного комбинирования различных ферментов, UDP-сахаров и акцепторов, то могут быть получены определенные монодисперсные олигосахариды (рис. 5).

Иллюстрация 5. Приготовление определенных олигосахаридов.
В этом примере, акцептор ГК тетрасахарид удлинняется одиночной хондроитин дисахаридной единицей, используя два шага с иммобилизованным мутантом синтазы вида Pasteurella (показано белыми стрелками). Изображенный продукт является новым гексасахаридом. Повторение цикла еще раз производит олигосахарид, два цикла формируют декасахарид, и т.д. Если акцептор был ранее соединен с другой молекулой (например препарат или лекарство), тогда новый конъюгат был бы удлиннен коротким ГК, хондроитином или гибридной цепью как и желательно.

Например, в одном воплощении, смесь UDP-GlcNAc, UDP-GlcUA и акцептора постоянно циркулирует через отдельные биореакторы с иммобилизованными мутант-синтазами, которые передают только одиночный сахар. С каждым циклом инкубации биореактора другая сахарная группа добавляется к акцептору, чтобы сформировать маленькие определенные ГК олигосахариды. Использование похожего пмЦС мутанта (например GalNAc-Tase) в одном из шагов позволило происходить формированию смешанных олигосахаридов при использовании UDP-GlcNAc. Биологическая активность и терапевтический потенциал маленьких ГК олигосахаридов - сложная область для исследования, которая потребует определенных, монодисперсных сахаров для однозначной интерпретации.

Заключение

Очевидно, существуют два различных класса ГК синтаз. Наиболее хорошо охарактеризован фермент класса II вида Рasteurella, удлинняющий цепь ГК повторяющимся присоединением одиночного сахара на невосстанавливающийся конец цепи ГК. Направление и способ работы синтаз класса I (стрептококковые, вирусные и ферменты позвоночных) остаются неясными. Относительно прикладных наук, способность пмГКС удлиннять экзогенно расположенные акцепторные молекулы полезна для создания новых молекул и/или устройств с потенциальным медицинским применением.